免疫熒光細胞化學技術
免疫熒光細胞化學是現代生物學和醫學中廣泛應用的技術之一，是由Coons等（1950）建立，經過近43年的發展，免疫熒光技術與形态學技術相結合發展成免疫熒光細胞（或組織）化學。它與親合化學技術如葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素與卵白素、植物血凝素（ConA等）相結合拓寬瞭(le)領域；與激光技術、電子計算機和掃描電視等技術結合發展爲定量免疫熒光細胞化學技術；熒光激活細胞分類器（FACS）的應用使免疫熒光細胞化學技術發展到更高的階段 ，開創瞭(le)免疫熒光技術的新領域。細胞顯微分光光度計與與圖像分析儀的結合使免疫熒光組織化學的定量檢測更加準確(què)。在免疫熒光細胞化學中應用單克隆抗體日益增多，将會不斷提高特異性、敏感性和應用範圍。激光掃描等聚集顯微鏡的應用又開創瞭(le)新的發展時代 。
由於(yú)免疫熒光細胞化學的特異性 ，快速性和在細胞和分子水平定位的敏感性與準確(què)性，在免疫學、微生物學、細胞和組織學 、病理學、腫瘤學以及臨床檢驗學等生物學和醫學許多方面得到廣泛應用，日益發揮重要的作用。
*節(jié) 免疫熒光細(xì)胞化學的原理
免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體反應的原理，先将已知的抗原或抗體标記上熒光素制成熒光标記物 ，再用這種熒光抗體（或抗原）作爲分子探針檢查細胞或組織内的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體複合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察标本 ，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確(què)定抗原或抗體的性質 、定位，以及利用定量技術測(cè)定含量（圖3-1）。
圖(tú)3-1 紫外光激發(fā)熒光物質放射熒光示意圖(tú)
用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱(chēng)熒光抗體法；用已知的熒光抗原标記(jì)物示蹤或檢查相應抗體的方法稱(chēng)熒光抗原法 。這兩種方法總稱(chēng)免疫熒光技術，以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織内抗原或半抗原物質等方法稱(chēng)爲免疫熒光細胞（或組織）化學技術 。
免疫熒光細胞化學分直接法 、夾(jiā)心法、間接法和補(bǔ)體法。
一、直接法
1．檢(jiǎn)查抗原法 這是zui早的方法，用已知特異性抗體與熒光素結合，制成熒光特異性抗體，直接與細胞或組織中相應抗原結合 ，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現特異性熒光。此法很特異和簡(jiǎn)便 ，但一種熒光抗體隻能檢(jiǎn)查一種抗原 ，敏感性較差（圖3-2）。
圖3-2 直接法
2．檢查抗體法 将抗原标記(jì)上熒光素，即爲熒光抗原，用此熒光抗原與細胞或組織内相應抗體反應 ，而将抗體定位檢測(cè)出來 。
二、間接法
1．檢查抗體法（夾(jiā)心法） 此法是先用特異性抗原與細胞或組織内抗體反應，再用此抗原的特異性熒光抗體與結合在細胞内抗體上的抗原相結合 ，抗原夾(jiā)在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱(chēng)夾(jiā)心法 。
2．檢查抗體法 用已知抗原細胞或組織标本的切片，加上待檢血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉澱(diàn)結合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體）與結合在抗原上的抗體反應（如檢測(cè)人血清中的抗體必需用抗人IgG熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應部位呈現明亮的特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段（圖3-3）
圖3-3 間接法
3．檢查抗原法雙薄片 此法是直接法的重要改進 ，先用特異性（對細胞或組織内抗原）抗體（或稱*抗體）與細胞标本反應 ，随後用緩沖鹽水洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體（也稱第二抗體，種特異性）與結合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結合，形成抗原-抗體-熒光抗體的複合物 。由於(yú)結合在抗原抗體複合物上的熒光抗全顯著多於(yú)直接法，從而提高瞭(le)敏感性。如細胞抗原上每個分子結合3～5個分子抗體，當此抗體作爲抗原時又可結合3～5分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強3至4倍。此法除靈敏性高外，它隻需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以适用於(yú)多種*抗體的标記顯示。這是現在zui廣泛應用的技術。
三、補體法
1．直接檢查組織内免疫複合物法 用抗補(bǔ)體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結合在抗原抗體複合物上的補(bǔ)體反應，而形成抗原抗體補(bǔ)體複合物---抗補(bǔ)體熒光抗體複合物，在熒光顯微鏡下呈現陽性熒光的部位就是免疫複合物的存在處，此法常用於(yú)腎穿刺組織活檢診斷等。
圖3-4 補體法
2．間接檢查組織内抗原法 常将新鮮補(bǔ)體與*抗體混合同時加在抗原标本切片上，經37℃孵育後，如發生抗原補(bǔ)體抗體反應，補(bǔ)體就結合在此複合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結合的補(bǔ)體反應，形成抗原抗體—抗補(bǔ)體熒光抗體的複合物 ，此法優點是隻需一種熒光抗體可适用於(yú)各種不同種屬來源的*抗體的标記顯示 。
四、雙(shuāng)重免疫熒光标記(jì)法
在同一細胞組織标本上需要同時檢查兩種抗原時 ，要進行雙重熒光染色 ，一般均採(cǎi)用直接法，将兩種熒光抗體（如抗A和抗B）以适當比例混合 ，加在标本上孵育後 ，按直接法洗去未結合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素标記 ，發黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200标記 ，發紅色熒光 ，可以明確(què)顯示兩種抗原的定位。
五、對照試驗
爲瞭(le)保證免疫熒光細胞化學染色的準確(què)性，排除某些非特異性染色 ，必須在初次試驗時進行以上對照試驗：
1．直接法 需設(shè)下述對(duì)照試驗
（1）标本自發熒光對(duì)照：标本隻加PBS或不加PBS，緩沖(chōng)甘油封片，熒光顯微鏡觀察應呈陰性熒光（無與特異性熒光相似的熒光）。
（2）抑制試(shì)驗 ：可分爲(wèi)二步法和一步法。
①二步抑制法：标本先加未标記(jì)的特異性抗體 ，再加标記(jì)熒光抗體，結果應呈陰性或明顯減(jiǎn)弱的熒光。
②一步抑制法：先将熒光抗體用未标記(jì)抗體作适量混合，再加在标本上染色，結果應爲陰性。此法效果較二步法好，並(bìng)且簡便。
（3）陽性對(duì)照：用已知陽性标本作直接法免疫熒光染色，結(jié)果應呈陽性熒光。
如對(duì)照（1）和（2）無熒光或弱熒光，（3）和待檢(jiǎn)查标本呈強熒光即爲特異性陽性熒光。
2．間接法
（1）自發(fā)熒光對(duì)照：同上（一）。
（2）熒光抗體對(duì)照：标本隻加間(jiān)接熒光抗體染色，結果陰性 。
（3）抑制試(shì)驗(yàn) ：同上。
（4）陽(yáng)性對(duì)照 ：同上。
如對(duì)照（1）、（2）、（3）均呈陰性，陽性對(duì)照和待檢(jiǎn)标本陽性則爲特異性熒光。
3．補體法
（1）自發熒光對照
（2）熒光抗體對照
（3）抑制試驗
（4）補(bǔ)體對(duì)照：取新鮮豚鼠血清1：10稀釋先作用标本 ，再用抗補(bǔ)體熒光抗體染色 ，結果陰性。
（5）抑制試驗 ：标本加滅活的*抗體 ，再用1：10稀釋度的新鮮豚鼠血清孵育後(hòu) ，再加未标記的抗補(bǔ)體血清與抗補(bǔ)體熒光抗體等量混合稀釋液，結果應爲陰性。
（6）陽性對(duì)照：（1）～（5）結果陰性，（6）和待檢(jiǎn)标本陽性時 ，則爲特異性熒光 。
第二節 熒光抗體的制備
熒光抗體是免疫熒光細胞化學的重要技術之一，制備(bèi)高特異性和價(jià)的熒光抗體必須選用高質量的熒光素和高特異性價(jià)的免疫血清。
一、熒光素
熒光是指一個分子或原子吸收瞭(le)給予的能量後即刻引起發光 ，停止能量供給，發光也瞬時停止（一般持續10-7～10-8s）。可以産(chǎn)生明亮熒光的染料物質，稱熒光色素。目前主要常用的熒光色素有以下3種：
（一）異(yì)硫氰酸熒(yíng)光素（Fluorescein isothiocyanate, GITC）
呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結晶，性質穩定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶於(yú)水和酒精。zui大吸收光譜爲490～495nm，zui大發(fā)射光譜爲520～530nm，呈現黃綠色熒光，分子量爲398.4（圖3-5）。
在堿(jiǎn)性條件下，FITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成爲标記(jì)熒光免疫球蛋白 ，即熒光抗體 。反應式如下（圖3-6）：
一個(gè)Ig分子上zui多能 标記(jì)15～20個(gè)FITC分子。
圖3-5 FITC的吸收光譜(pǔ)和發(fā)射光譜(pǔ)
圖3-6 抗體(tǐ)的FITC标記(jì)反應式
（二）四乙基羅(luó)達(dá)明（tetraethylrodamine B200, RB200）
呈褐紅色粉末 ，不溶於(yú)水 ，易溶於(yú)酒精和丙酮，性質穩定 ，可長(zhǎng)期保存 。zui大吸收光譜爲570nm，zui大發射光譜爲595～600nm,呈明亮橙紅色熒光。分子量爲580（圖3-7）。
RB200在五氯化磷（PCl5）作用下轉變(biàn)成磺酰氯（SO2Cl），在堿性條件下易與蛋白質的賴氨酸ε-氨基反應結合而标記(jì)在蛋白分子上。化學反應式如下（圖3-8）。
圖3-7 RB200在可見(jiàn)光區的吸收 圖3－8 RB200标記(jì)抗體反應
光譜和熒光光譜
圖3-8 RB200标記(jì)抗體(tǐ)反應
（三）四甲基異硫氰酸羅(luó)達(dá)明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）
它是一種紫紅色粉末，較穩定。其zui大吸收光譜爲550nm，zui大發射光譜620nm，呈橙紅色熒光 ，與FITC的黃綠色熒光對(duì)比清晰（圖3-9），與蛋白質結合方式同TITC。它可用於(yú)雙标記示蹤研究。化學結構式如下（圖3-10）。
圖3-9 TMRITC在可見(jiàn)光區(qū)的吸收
光譜和發射光譜
圖3-10 TMRITC結(jié)構(gòu)式
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二 、熒光素标記(jì)抗體(tǐ)的方法
（一）FITC标記(jì)抗體(tǐ)的方法
1．Marsshall 氏法
（1）材料：抗體球蛋白溶液 、0.5mol/l pH9.0碳酸鹽緩沖(chōng)液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素 、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或1000ml燒杯）、電(diàn)磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋 、玻棒 、棉線及燒杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等 。
（2）方法及步驟(zhòu)：
①抗體的準備(bèi)：取适量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中 ，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖(chōng)液，使zui後蛋白濃度爲20mg/ml，緩沖(chōng)液容量爲總量的1/10，混勻 ，将三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度适當以不起泡沫爲宜）5～10min。
②熒光素的準備(bèi)：根據欲标記的蛋白質總量，按每毫克蛋白加0.01mg 熒光素，用分析天平準確(què)稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。
③結合（或稱标記）：邊攪拌邊将稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免将熒光素粘於(yú)三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min内加完），加畢(bì)後 ，繼續攪拌12～18h。結合期間應保持蛋白溶液於(yú)4℃左右，故須及時添冰去水；亦可将結合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中 。
④透析：結合完畢(bì)後，将球蛋白的溶液離心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉澱物，裝入透析袋中後再置於(yú)燒杯中 ，用pH8.0緩沖鹽水透析（0～4℃）過夜。
⑤過(guò)柱 ：取透析過(guò)夜的标記(jì)物，過(guò)葡聚糖凝膠G-25或G-50柱 ，分離遊離熒光素，收集标記(jì)的熒光抗體進行鑒定（圖3-11，圖-3-12）。
圖(tú)3-11 Sephadex G-25 對(duì)FITC
圖3-12 FITC與家兔IgG球蛋白在25℃和2℃時結(jié)合的動(dòng)力學（Kawamura 1964）
洗脫液 ：0.01mol/L磷酸鹽緩沖(chōng)液（pH7.2）;過(guò)濾量:12ml标記蛋白液（過(guò)濾前未透析）;收集量:20ml（稀釋1.7倍）。
分别以1mgFITC溶於(yú)2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸鹽緩沖(chōng)液（分别爲pH9.5和pH9.0），於(yú)2℃下攪拌将其各加入100mg家兔IgG生理鹽水溶液中，攪勻後立即将每份分爲兩半 。一半保留於(yú)2℃下，另一半置25℃下 。間隔一定時間後各取出0.5ml通過sephadex G-25去遊離FITC，由上計算出5mg家兔IgG結合的FITC量 。
2．Chadwick 氏法
（1）材料：抗原球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸鹽緩(huǎn)沖(chōng)鹽水、1%硫柳汞、離心機及離心管、三角燒瓶（25ml）、冰槽 、無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml）、透析袋 、棉線 、玻棒等。
（2）方法及步驟(zhòu) ：
①抗體準備(bèi)：用0～4℃pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水将球蛋白溶液稀釋至濃度爲30～40mg/ml，置入三角燒瓶内，放於(yú)冰槽中。
②熒光色素準備(bèi)：按每毫克蛋白加入熒光素0.01mg計算，稱(chēng)取所需之熒光素量 ，用3%重碳酸鈉水溶液溶解 。
③将準備(bèi)之抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪(jiǎo)勻 ，在0～4℃，冰箱中結合18～24h。
④透析和柱層(céng)析：方法同Marshall 氏法。
3．改良法（1963年） 根據Marshall 氏法取高價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0.15mol/l NaCl）及緩沖液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0） 稀釋使每毫升内含蛋白10mg,緩沖液爲總量的10%，降溫至4℃，加入異硫氰酸鹽熒光素，（蛋白：熒光素=50～80mg:1mg），在0～4℃下電磁攪拌12～14h。然後用半飽(bǎo)和和硫酸铵将标記球蛋白沉澱分離，除去未結合的熒光素，再用緩沖鹽水透析 ，除去硫酸铵（用Nessler氏試劑測驗至隔夜透析之鹽水無氨離子及熒光色素爲止）。将制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%,分裝在1ml安瓿中，或凍幹，保存於(yú)冰箱中（4℃）可以用半年以上，-20℃保存可達2年以上。
【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶於(yú)2000ml蒸餾(liú)水中，校定pH至7.2。
【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖(chōng)液配法：取0.5mol/l Na2CO3（5.3%）10ml加入0.5mol/l NaHCO3（4.2%）90ml,混合後(hòu)，校定pH至9.0。
【附三】3%重碳酸鈉水溶液配法：稱(chēng)1.5g無水重碳酸鈉充分溶解於(yú)50ml滅菌蒸餾水中即成 。
4．透析标記(jì)法 此法适用於(yú)小量抗體的熒光素标記(jì)，标記(jì)簡便，非特異性染色較少 。
（1）用0.025mol/L碳酸鹽緩(huǎn)沖(chōng)液pH9.0，将欲标記免疫球蛋白稀釋成1%濃度 ，裝入透析袋中。
（2）用同一緩沖液将FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液體積的10倍，将FITC稀釋液盛於(yú)圓柱形容器内，並(bìng)使透析袋浸沒於(yú)FITC液中。容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4℃電磁攪拌下，透析标記24h。取出透析袋中标記液，即刻用sephadex G-50 凝膠過濾，去除遊離熒光素，分裝、貯存於(yú)4℃中（圖3-13）。
圖3-13 标記抗體溶液通過sephadex 産(chǎn)膠柱層(céng)析分布
（二）四乙基羅達(dá)明标記(jì)抗體方法
取1g RB200及PCL52g放在乳缽(bō)中研磨5min（在通風櫥(chú)中）。然後加入10ml無水丙酮，放置5min，不斷攪拌。過濾，用濾液進行标記抗體 。剩餘部分吸附在濾紙上，4℃幹燥保存。
取抗體（20mg/ml）每毫升加入生理鹽水和0.5mol/l pH9.0的碳酸鹽緩沖液各1ml稀釋。逐滴加入0.1ml RB200溶液 ，邊加入邊攪拌，在0～4℃中結合12～18h，再用生理鹽水透析5～7h，經葡聚糖凝膠G-50柱層析，除去遊離熒光素，分裝，貯存於(yú)4℃備(bèi)用。
（三）四甲基異硫氰酸羅達(dá)明标記(jì)抗體方法
（1）Igg 10ml （6mg/ml）在0.01mol/l pH9.5碳酸鹽緩沖(chōng)液中透析過(guò)夜。
（2）将四甲基異硫近氰酸羅達(dá)明（每毫克IgG加入5～20μg）溶於(yú)二甲亞砜（1mg/ml）,取此溶液300μl，一滴一滴加入蛋白質溶液中，同時電磁攪拌。
（3）在室溫(wēn)中攪(jiǎo)拌2h，避光。
（4）把結合物移入直徑3cm,高30cm大小的Bio –Gel P-6層(céng)析柱（用0.01mol/l pH8.0的PBS平衡過(guò)），流速爲1.5ml/min。
（5）收集先流出的紅(hóng)色結合物，即爲标記抗體，分裝，4℃保存備(bèi)用。
（四）藻紅(hóng)蛋白标記(jì)抗體的方法
1．巯基化藻紅蛋白（phycoerthrin PE）的制備(bèi) ，600μl的15.5mg/ml鹽酸巯醇亞胺（iminothiolane hydrochloride）加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB、pH6.8 混合，裝入透析袋置入50mmol/l pH6.8 PB中透析 ，4℃過夜，再換用pH7.5PB透析6h。每個(gè)PE分子中可結合8個(gè)巯基 。
2．PE-IgG制備(bèi) 異雙功能試劑SPDP[n - Succ - inimdyl 3-（2-pyridyldlthio） propinate ] 30μl （1.1mg/ml）的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50mmol/l pH7.5），在室溫中反應2.5h。再加入巯基化Pe 400μl（1.7mg/ml）加到500μl反應混合液中 ，室溫反應12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸鈉封閉(bì)殘餘巯基 ，用PB透析過夜，4℃。加入0.01%Na3N3分裝，4℃保存半年。
（五）PE-标記(jì)蛋白A方法
（1）取4.08mg PE溶於(yú)0.1mol/l pH7.4PB（含0.1mol/l NaCl）1ml中，溶解後，取出0.5ml，再加入10μlSPDP無水甲醇液（2.65mg/ml）,SPDP/蛋白摩爾(ěr)比爲10，22℃反應5min，過Sephadex G-50（1×17cm）,用100mmol/l pH7.4 PBS（含0.1mol/l NaCl）平衡和洗脫。
（2）0.5ml蛋白（2mg/ml）100mmol/l PB（含有100mmol/l NaCl） pH7.4，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白=9.5,22℃,40min ,加入25μmol/L二硫蘇糖醇（DTT）pH7.4緩沖(chōng)液，22℃，25min，同上過(guò)Sephadex G-50，收集蛋白A峰 。
（3）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反應(yīng)6h，混合物4℃保存備(bèi)用。
以上兩種PE标記制品，可zui後(hòu)溶於(yú)0.01mol/l pH7.4PB（含有0.1mol/l DETA、1mol/L碘乙酰胺、1%BSA 和0.1%NaN3）,0～5℃保存。
（六）藍(lán)色熒光素标記(jì)抗體方法
Kbaffan等（1986）首先創(chuàng)立瞭(le)藍色熒光素标記和染色技術 ，可進行雙标記或多标記。
（1）取7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin, AMC）260μg溶於(yú)二甲亞(yà)砜25μl中。
（2）将上液加入10ml IgG的 巴比妥緩沖(chōng)液（0.5mol/L,pH8.5,内含50～100mg IgG）中，室溫反應2h，過(guò)Sephadex G-50除去遊離熒光素 。
AMC呈黃(huáng)色結晶固體，zui大吸收波長(zhǎng)354nm,zui大熒光波長(zhǎng)430nm。
三、熒(yíng)光抗體(tǐ)質量控制
對(duì)制備(bèi)的熒光抗體必須進行質量鑒定，主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。
（一）染色特異(yì)性和敏感性的測(cè)定
1．特異性染色效價的測(cè)定 直接染色以倍比稀釋熒光抗體溶液如1：2，1：4，1：8……，與相應抗原标本作一系列染色 ，熒光強度在“+++”的zui大釋釋度，即爲該熒光抗體的染色滴度（效價）或單(dān)位。實際染色應用時 ，可取低一個或兩個稀釋度（即2～4個單(dān)位），如染色效價爲1：64，實際應用時可取1：32或1：16。間接染色效價可按抗核抗體熒光染色法步驟，先用不同稀釋度的熒光抗體染色 ，結果以抗核抗體熒光強度“++”爲标準 ，染色用效價和直接法相同 。
2．非特異性染色測定 根據熒光抗體的用途不同 ，可用相類似的抗原切片或塗片，倍比稀釋熒光抗體 ，按常規染色，結果在标本上出現的非特異染色應顯著低於(yú)特異染色滴度，否則應採(cǎi)取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體 。
3．吸收試驗 在熒光抗體中加入過(guò)量相應抗原，於(yú)室溫中攪拌2h後，移入4℃中過(guò)夜，3000r/min,離心30min，收集上清液，再用以染相應抗原陽性标本，結果應不出現明顯陽性熒光 。
4．抑制試(shì)驗(yàn)如前述 。
（二）F/P比值的測(cè)定
F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質量，一般要求F/P的克分子比值爲1～2。過(guò)高時，非特異性染色增強(qiáng)；過(guò)低時，熒光很弱 ，降低敏感性。
1．蛋白質定量 測(cè)定熒光抗體(tǐ)的蛋白質mg/ml量。
2．結合熒光素定量 先制作熒光素定量标準曲線，即準確(què)稱取FITC1mg,溶於(yú)10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/l pH7.2PBS稀釋到100ml，此時熒光素含量爲10 μg/ml，以此爲原液，再倍比稀釋9個不同濃度的溶液，用分光光度計在490nm波長測定光密度值（OD），以光密度爲縱坐标，熒光素含量爲橫坐标，作标準函數圖。
熒光素與蛋白質結合後 ，其吸收光譜峰值向長(zhǎng)波方向位移約5nm,FITC和蛋白質結合後由490nm變(biàn)爲493～495nm，RB200和蛋白質結合後變(biàn)爲595nm。
F/P比值的計(jì)算：可按以下公式計(jì)算 。
式中160000爲抗體蛋白質的分子量，390爲FITC的分子量。蛋白質從(cóng)克換(huàn)算爲毫克需再乘以103，而熒光素從(cóng)克換(huàn)算爲微克需要再乘以106。
測(cè)定RB200熒光抗體(tǐ)的克分子比值公式如下 ：
按圖3-4測(cè)定法更爲簡便，即先用276nm波長(zhǎng)測(cè)得蛋白質的OD值，再用493波長(zhǎng)測(cè)得FITC的OD值，将這兩個OD值在圖3-14上連成一直線，直線與各縱線交叉處，即可查出标記抗體的以下數值：FITc μg/ml ，F/P 的μg/mg,F/P的克分子比值，蛋白mg/ml等。
圖3-14 FITC标記(jì)物中球蛋白、熒光色素和E/P比值計(jì)算圖
四 、熒光抗體的保存
以0～4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變(biàn)性。加入濃度爲1：5000～10000的硫柳汞或1：1000～5000的疊氮鈉防腐，小量分裝如0.1～1ml，真空幹燥後更易長(zhǎng)期保存 。
[NextPage] 第三節 免疫熒光細胞化學染色方法
一、标本制作
可制作塗片 、印片 、細胞單(dān)層(céng)培養物 、組織切片，經适當固定或不固定，作免疫熒光染色用。
二、熒(yíng)光抗體(tǐ)染色方法
（一）直接法
1．染色 切片經固定後(hòu) ，滴加經稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒内 ，防止幹(gàn)燥 。
2．洗片 傾去存留的熒光抗體，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪(jiǎo)拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。
3．用50%緩(huǎn)沖(chōng)（0.5mol/L碳酸鹽緩(huǎn)沖(chōng)液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢
4．對照染色
①正常免熒光血清染色，如上法處(chù)理切片 ，結果應爲陰性。②染色抑制試驗（一步法）：将熒光抗體和未标記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合 ，如上法處(chù)理切片 。結果應爲陰性。爲證明此種染色抑制不是由於(yú)熒光抗體被稀釋所緻 ，可用鹽水代替未标記抗血清，染色結果應爲陽性。此法結果較二步法穩定。③類屬抗原染色試驗，前面已作叙述 。
直接法比較簡單(dān)，适合做細菌 、螺旋體、原蟲(chóng) 、真菌及濃度較高的蛋白質抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體隻能檢查一種相應的抗原，特異性高而敏感性較低 。
（二）間接法
（1）切片固定後用毛細滴管吸取經适當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置於(yú)染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然後用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹幹餘留的液體。
（2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩(huǎn)沖(chōng)鹽水洗兩次10min，攪拌，緩(huǎn)沖(chōng)甘油封固，鏡檢。
對(duì)照染色：①抗體對(duì)照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結(jié)果應爲陰性。②抗原對(duì)照：即類屬抗原染色，亦應爲陰性。③陽性對(duì)照 。
間接法中上述方法稱(chēng)雙層(céng)法（Double Layer Method）。另一種稱(chēng)夾心法，即用未标記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合 ，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在 ，方法步驟如下 ：
①切片或塗片固定後(hòu) ，置於(yú)染色濕盒内。
②滴加未标記(jì)的特異性抗原作用切片於(yú)37℃，30min。
③緩沖(chōng)鹽水洗2次，每次5min，吹幹(gàn)。
④滴加特異性熒光抗體(tǐ)再用切片於(yú)37℃，30min。
⑤如③水洗。
⑥緩(huǎn)沖(chōng)甘油封固，鏡檢。
間接法隻需制備(bèi)一種熒光抗體可以檢出多種抗原 ，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備(bèi)動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應用於(yú)自身抗體和感染病人血清的試驗 。
（三）補體法
1．材料
（1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補(bǔ)體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清 ，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結合的效價(jià)，如爲1：32則免疫血清應作1：8稀釋。
（2）補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補(bǔ)體結合反應試管法所測定的結果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備(bèi)用 。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量爲0.01%濃度。
（3）抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價爲1：4，補(bǔ)體爲2單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然後按染色效價1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備(bèi)用。
2．方法步驟
（1）塗(tú)片或切片固定 。
（2）吸取經适當稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液（此時免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍）滴於(yú)切片上，37℃作用30min，置於(yú)保持一定濕度的染色盒内。
（3）用緩沖(chōng)鹽水洗2次 ，攪拌 ，每次5min，吸幹(gàn)标本周圍水液。
（4）滴加經過适當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。
（5）蒸餾水洗1min，緩(huǎn)沖(chōng)甘油封固。
3．對照染色
（1）抗原對照 。
（2）抗血清對(duì)照：用正常兔血清代替免疫血清。
（3）滅活補(bǔ)體對照：将補(bǔ)體經56℃30min處(chù)理後 ，按補(bǔ)體同樣比例稀釋 ，與免疫血清等量混合後，進行補(bǔ)體法染色。
本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制 ，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應用 ，敏感性亦較間接法高，效價低的免疫血清亦可應用 ，節 省免疫血清，尤其是對(duì)檢查形态小的如立克氏體 、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質時甚爲理想。
（四）膜抗原熒(yíng)光抗體(tǐ)染色法
本法應用直接法或間接法的原理和步驟，可對活細胞在試管内進行染色，常用於(yú)T和B細胞 、細胞培養物、瘤細胞抗原和受體等的檢查和研究，陽性熒光主要在細胞膜上 。FACS即採(cǎi)用此法原理 。
（五）雙重染色法
在同一标本上有兩個抗原需要同時顯示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗體用FITC标記，B抗原的抗體用羅達(dá)明标記，可採(cǎi)用以下染色方法：
1．一步法雙染色 先将兩種标記(jì)抗體按适當(dāng)比例混合（A+B），按直接法進行染色。
2．二步法雙染色 先用RB200标記(jì)的B抗體染色 ，不必洗去 ，再用FITC标記(jì)的A抗體染色 ，按間(jiān)接法進行。
結(jié)果：A抗原陽性熒光呈現綠色，B抗原陽性呈現桔紅(hóng)色熒光。
（六）熒(yíng)光抗體(tǐ)再染色法
若切片或其他标本經某種熒光抗體染色後(hòu) ，未獲(huò)得陽性結果，而又疑有另外的病原體存在時 ，可用相應的熒光抗體再染色。
有時存檔(dàng)蠟塊不能再用以切片 ，也可用存檔(dàng)的HE染色标本 ，褪去蓋(gài)片和顔色 ，再作免疫熒光或其它免疫細胞化學的染色。
三 、熒光抗原染色法
某些抗原可以用熒光素标記，制成熒光抗原，标記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同 。用熒光抗原可以直接檢查細胞或組織内的相應抗體 ，特異性較好，敏感性較差 。染色方法同熒光抗體染色的直接法 。由於(yú)多數抗原難以提純或量少不昂貴，一般很少採(cǎi)用此法 。
第四節 熒光顯微鏡檢查法
一 、熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具 。它是由光源、濾闆系統和光學系統等主要部件組成 。是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)标本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統放大以觀察标本的熒光圖像（圖3-15）。
圖3-15 熒光顯微鏡(jìng)的結構(gòu)和主要部件
（一）光源
現在多採(cǎi)用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，内充一定數量的汞 ，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發，球内氣壓迅速升高，當水銀*蒸發時 ，可達(dá)50～70個标準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發射光量子的結果 。它發射很強的紫外和藍紫光，足以激發各類熒光物質，因此，爲熒光顯微鏡普遍採(cǎi)用。
超高壓汞燈(dēng)也散發(fā)大量熱能。因此 ，燈(dēng)室必須有良好的散熱條件，工作環境溫度不宜太高。
新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間後 ，則需要高壓啓動（約爲15000V），啓動後 ，維持工作電壓一般爲50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約爲200h，開動一次工作時間愈短 ，則壽命愈短 ，如開一次隻工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時盡量減少啓動次數。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅後要等待冷卻才能重新啓動。點燃燈泡後不可立即關閉(bì) ，以免水銀蒸發不*而損壞電極，一般需要等15min。由於(yú)超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發生爆炸時造成操作。
超高壓汞燈(dēng)（100W或200W）光源的電路和包括變(biàn)壓、鎮流、啓動幾個部分。在燈(dēng)室上有調節 燈(dēng)泡發光中心的系統，燈(dēng)泡球部後面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡 。
國産(chǎn)超高壓汞燈(dēng)GCQ-200型性能良好 ，可以代替HBO-200等型的進口燈(dēng)泡，平均壽命在200h以上，價格也比較低 。
我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶(dài)直流電源），易於(yú)攜帶(dài)，使用方便，已推廣應用。
（二）濾色系統
濾色系統是熒光顯微鏡的重要部位 ，由激發濾闆和壓制濾闆組成。濾闆型号 ，各廠家名稱常不統一。濾闆一般都以基本色調命名，前面字母代表色調 ，後面字母代表玻璃，數字代表型号特點。如德國産(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍色玻璃，B是藍色的*個字母 ，G是玻璃的*個字母；我國産(chǎn)品的名稱已統一用拼音字母表示，如相當於(yú)BG12的藍色濾闆名爲QB24，Q是青色（藍色）拼音的*個字母，B是玻璃拼音的*個字母。不過有的濾闆也可以透光分界濾長命名，如K530，就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾闆*以數字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當於(yú)BG12。
用於(yú)熒光顯微鏡(jìng)的主要濾闆如表3-1。
表3-1 熒光顯微鏡(jìng)常用濾闆型号和透光特點(diǎn)
| 基本色調 | 相應名稱 | 2mm厚透光範圍（峰值）nm | |||
| 上海電器元件廠 | 德國（Schott） | 蘇聯 | 日本 | ||
| 黑紫 | ZWB-1 | UG-1 | yΦC-2 | DV-1 | 300～400（365） |
| 黑紫 | ZWB-2 | UG-5 | yΦC-1 | 280～240（360） | |
| 靛藍 | ZB-2 | BG-1 | ΦC-1 | BG-1 | 300～500（380） |
| 靛藍 | ZB-3 | BG-3 | CC-4 | BG-3 | 260～520（400） |
| 靛藍 | QB-24 | BG-12 | CC-8 | BG-12 | 310～570（420） |
| 淡藍 | QB-10 | BG-38 | C3C-5 | 310～720（460） | |
| QB-12 | -8 | ||||
| -11 | |||||
| 橙黃 | CB-3 | OG-1（K530） | OC-11 | OG-1 | 530以上 |
| 橙黃 | JB-8 | OG-4（K510） | ЖC-18 | FY-5 | 510以上 |
| 綠橙 | JB-7 | GG-11（K490） | ЖC-17 | FY-3 | 480以上 |
| FY-4 | |||||
| 淡綠 | JB-4 | GG-3（K430） | жC-11 | US-10 | 420以上 |
引自 ：五九一節 五*編(biān) ：熒光顯微術，見參(cān)考資料）
1．激發濾闆 根據光源和熒光色素的特點(diǎn) ，可選用以下三類激發濾闆，提供一定波長(zhǎng)範圍的激發光。
紫外光激發(fā)濾闆：此濾闆可使400nm以下的紫外光透過，阻擋(dǎng)400nm以上的可見光通過 。常用型号爲UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發(fā)濾闆 ：此濾闆可使300～450nm範(fàn)圍内的光通過 。常用型号爲ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發(fā)濾闆：它可使350～490nm的光通過(guò)。常用型号爲QB24（BG12）。
zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達(dá)明色素）可用藍綠濾闆（如B-7）激發(fā) 。
近年開始採(cǎi)用金屬膜幹涉濾闆，由於(yú)針對性強，波長适當，因而激發效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITCKP490濾闆和羅達明的S546綠色濾闆，均遠比玻璃濾闆效果好。
激發(fā)濾闆分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾闆，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些 。基本要求是以獲(huò)得zui明亮的熒光和的背景爲準。
2．壓制濾闆 壓制濾闆的作用是*阻擋(dǎng)激發光通過，提供相應濾長(zhǎng)範圍的熒光。與激發濾闆相對應 ，常用以下3種壓制濾闆 ：
紫外光壓制濾闆：可通過(guò)可見光、阻擋(dǎng)紫外光通過(guò)。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍光壓制濾闆 ：能通過(guò)510nm以上濾長(zhǎng)的熒光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾闆：能通過(guò)460nm以上波長(zhǎng)的熒光（藍到紅），可與BG-3組合 ，常用OG-11K470AK 490，K510。
（三）反光鏡
反光鏡的反光層(céng)一般是鍍鋁的 ，因爲鋁對紫外光和可見光的藍紫區吸收少，反射達(dá)90%以上，而銀的反射隻有70%；一般使用平面反光鏡。
（四）聚光鏡
專爲熒光顯微鏡設計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種 。還(hái)有相差熒光聚光器。
1．明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特别适於(yú)低、中倍放大的标本觀(guān)察。
2．暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應用日益廣泛 。因爲激發光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發光也不進入目鏡，可以使用薄的激發濾闆，增強激發光的強度 ，壓制濾闆也可以很薄，因紫外光激發時，可用無色濾闆（不透過紫外）而仍然産(chǎn)生黑暗的背景。從而增強瞭(le)熒光圖像的亮度和反襯度 ，提高瞭(le)圖像的質量，觀察舒适，可能發現亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。
3．相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和熒光聯合觀察 ，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助於(yú)熒光的定位準確(què) 。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。
（五）物鏡
各種物鏡均可應用 ，但用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長範圍）适合於(yú)熒光。由於(yú)圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數成反比 ，所以爲瞭(le)提高熒光圖像的亮度，應使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時其影響非常明顯 。因此對熒光不夠強的标本，應使用鏡口率大的物鏡 ，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。
（六）目鏡
在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單(dān)筒目鏡 ，因爲其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀(guān)察很方便。
（七）落射光裝置
新型的落射光裝置是從光源來的光射到幹涉分光濾鏡後，波長短的部分（紫外和紫藍）由於濾鏡上鍍膜的性質而反射 ，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡，經物鏡射向标本，使标本受到激發，這時物鏡直接起聚光器的作用 。同時，濾長長的部分（綠、黃、紅等），對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射 ，濾鏡起瞭(le)激發濾闆作用 ，由於标本的熒光處在可見光長波區，可透過濾鏡而到達目鏡觀察 ，熒光圖像的亮度随著(zhe)放大倍數增大而提高，在高放大時比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更适用於不透明及半透明标本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養标本等的直接觀察 。近年研制的新型熒光顯微鏡多採用落射光裝置 ，稱之爲落射熒光顯微鏡。
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二、熒光顯(xiǎn)微鏡(jìng)标本制作要求
（一）載玻片
載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間(jiān)，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在标本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻 ，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。
（二）蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。爲瞭(le)加強激發光，也可用幹涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若幹層(céng)對不同波長的光起不同幹涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光女可激發标本。
（三）标本
組織切片或其他标本不能太厚 ，如太厚激發光大部分消耗在标本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重疊(dié)或雜質掩蓋，影響判斷(duàn)。
（四）封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明 ，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以 ，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖(chōng)液的等量混合液作封裱劑。
（五）鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀(guān)察标本時 ，必須使用鏡油，使用特制的無熒光鏡油 ，也可用上述甘油代替 ，液體石蠟也可用，隻是折光率較低 ，對(duì)圖像質量略有影響。
三、使用熒光顯(xiǎn)微鏡(jìng)的注意事項
（1）嚴格按照熒光顯微鏡出廠(chǎng)說明書要求進行操作，不要随意改變(biàn)程序。
（2）應在暗室中進行檢查 。進入暗室後，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈(dēng)5～15min，待光源發出強光穩定後，眼睛*适應暗室，再開始觀察标本。
（3）防止紫外線對(duì)眼睛的損害 ，在調(diào)整光源時應戴上防護眼鏡 。
（4）檢查時間每次以1～2h爲宜，超過90min，超高壓汞燈(dēng)發(fā)光強度逐漸下降 ，熒光減弱；标本受紫外線照射3～5min後，熒光也明顯減弱；所以，zui多不得超過2～3h。
（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，标本應集中檢查 ，以節 省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈(dēng)泡應從(cóng)開始就記錄使用時間。燈(dēng)熄滅後欲再用時，須待燈(dēng)泡充分冷卻後才能點燃 。一天中應避免數次點燃光源。
（6）标本染色後立即觀察 ，因時間久瞭(le)熒光會逐漸減弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存 ，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。
（7）熒光亮度的判斷(duàn)标準：一般分爲四級，即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確(què)可見的熒光。“++”—可見有明亮的熒光。“+++”—可見耀眼的熒光。
四、熒光圖像的記(jì)錄(lù)方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形态學特征，二是具有熒光的顔色和亮度 ，在判斷結果時 ，必須将二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指标，即憑工作者目力觀察 。作爲一般定性觀察，基本上可靠的。随著(zhe)技術科學的發展 ，在不同程度上採(cǎi)用客觀指标記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀的判斷。
熒光顯微鏡攝影技術對於(yú)記錄熒光圖像十分必要，由於(yú)熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。隻是需要採(cǎi)用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的标記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以 ，曝光速度太慢，就不能将熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統裝置。
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第五節(jié) 非特異(yì)性染色的消除方法
一、非特異(yì)性染色的主要因素
組織的非特異性染色的機理很複雜，其産(chǎn)生的原因主要可分爲以下幾點(diǎn)：
（1）一部分熒光素未與蛋白質結(jié)合，形成瞭(le)聚合物和衍化物 ，而不能被透析除去。
（2）抗體(tǐ)以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。
（3）除去檢(jiǎn)查的抗原以外，組織中還(hái)可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。
（4）從組織中難於(yú)提純抗原性物質，所以制備(bèi)的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以緻容易混淆。
（5）抗體分子上标記的熒光素分子太多，這種過量标記的抗體分子帶(dài)過多的陰離子 ，可吸附於(yú)正常組織上而呈現非特異性染色。
（6）熒光素不純(chún)，标本固定不當(dāng)等。
二、消除非特異(yì)性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據産(chǎn)生的原因採(cǎi)取适當的方法，常用的方法有以下幾種：
（一）動(dòng)物髒(zàng)器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動(dòng)2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次後，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收後之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應作吸收前後之比較，吸收時可先用緩沖(chōng)鹽水将組織幹粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對(duì)熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織幹粉或勻漿沉澱(diàn)物吸收之。
用髒器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據Hiramotos氏等的方法将組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min 10min離心沉澱(diàn)，用其沉澱(diàn)物吸收其熒光抗體即能*達(dá)到目的，京極方久氏認爲這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收後放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）将若幹隻小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝髒，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝(bō)掉表面的結締(dì)組織的脂肪。
（2）剪碎，用生理鹽水反複洗滌(dí)至無血色止，然後再加生理鹽水少許，用組織搗(dǎo)碎機或勻漿器作成勻漿。
（3）将肝勻漿裝入離心管内（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反複洗滌(dí)各三次，至上清無血色止，每次完畢(bì)先用2000r/min離心沉澱15min後，再除去上清液。
（4）zui後用丙酮洗滌(dí)肝漿，再用布氏漏鬥過濾，或離心沉澱(diàn)，将沉澱(diàn)物平鋪在潔淨的玻璃闆上，37℃烤幹（過夜）。
（5）在乳缽(bō)中充分研磨，用120目銅篩篩選過後，分裝，密封，低溫幹(gàn)燥保存。
（二）透析法
熒光素如FITC分子可以通過(guò)半透膜，而蛋白質大分子不能透過(guò)，可将未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。
（1）将标記(jì)完畢(bì)的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋内，液面稍留空隙，緊紮。
（2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（懸於(yú)大於(yú)标記物體積約50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更換(huàn)3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝膠(jiāo)G-50柱層(céng)析法
除遊離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章 。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱内，待即将全部入柱時，加入PBS少許，關閉下口，停留30～40min ，使遊離熒光充分進入細篩孔中，然後再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量後，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留於上端的遊離熒光素之間拉開明顯的界線，随著(zhe)大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體zui先流出，分前、中、後三部分收集，測F/P比值，合格者合並(bìng)，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發生沉澱反應），繼續洗脫，遊離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素後，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的遊離熒光素和硫酸铵等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未*洗脫時即出現NH4+，因而影響提純(chún)與回收蛋白，一般待洗脫液出現蛋白時，即進行收集，之後出現SO4++（用1%BaCl2檢查發生白色沉澱(diàn)）。zui後是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉澱(diàn)），待洗脫液無SO4++及NH4+後可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層(céng)析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過(guò)濾2～3.5ml熒光抗體。
（四）DEAE纖維(wéi)素柱層(céng)析法
标記過(guò)多或過(guò)少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層(céng)析法除去。方法如下：
DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純(chún)IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以幹(gàn)重每克交換20～50mg标記蛋白量爲宜。常用梯度洗脫法如下：
（1）層(céng)析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标記物上柱後(hòu)，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據床體積大小每梯度乘3），然後(hòu)依下列各種離子強度洗脫液，分别洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脫(tuō)部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脫(tuō)部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脫(tuō)部分3。
将此三部分收集液（每管5ml）分别測定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合並(bìng)，濃縮保存備(bèi)用。因這部分非特異性染色熒光zui少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。
（2）柱上吸附的過(guò)度标記(jì)蛋白可繼續增加NaCl的濃度至2.0mol/L洗脫完。
經過DEAE-纖維素層(céng)析後的标記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測(cè)定的稀釋法除去非特異性染色。
（五）熒光抗體稀釋法
先測(cè)定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價(jià)，若二者效價(jià)相差較大，則可将熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價(jià)測(cè)定方法相同。
（六）純化抗原法
用各種方法提純單一成分的抗原是産生單價特異性抗體的zui主要條件。近代免疫化學技術（免疫吸收法）和柱層析法等提供瞭(le)很大的可能性，可參(cān)考有關專著。
（七）純(chún)化抗體(tǐ)法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的純(chún)化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原純(chún)度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應，爲此需要吸收，常採(cǎi)用純(chún)化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純(chún)化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制備(bèi) 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊(biān)加邊(biān)攪，5min即出現混濁，逐現大塊膠塊，放置30min後，用研缽将凝膠磨細，繼用1.0mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液反複洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即爲人IgG聚合物懸液。
2．免疫吸收法 将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉澱(diàn)，上清液即稀釋1倍的純(chún)化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏藍(lán)（Evans blue）襯(chèn)染法
用0.01%伊文氏藍的0.01mol/l pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可将背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少瞭(le)非特異性熒光，宜作常規應用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存於(yú)4℃，用前再稀釋至0.01%用以和然釋熒光抗體。
此外，還(hái)可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉(bì)法等消除非特異性染色，提高特異性染
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