（一）考馬斯亮蘭法實驗原理
雙縮脲法（Biuret法）和Folin―酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制 ，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測(cè)定法具有超過其他幾種方法的突出優點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質測(cè)定法。
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的zui大吸收峰的位置（lmax），由465nm變爲595nm，溶液的顔色也由棕黑色變爲蘭色。經研究認爲，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。
在595nm下測(cè)定的吸光度值A595，與蛋白質濃(nóng)度成正比。
Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是 ：
（1）靈敏度高 ，據估計比Lowry法約高四倍 ，其zui低蛋白質檢測(cè)量可達1mg。這是因爲蛋白質與染料結合後産生的顔色變(biàn)化很大，蛋白質－染料複合物有更高的消光系數 ，因而光吸收值随蛋白質濃度的變(biàn)化比Lowry法要大的多。
（2）測(cè)定快速、簡便，隻需加一種試劑。完成一個樣品的測(cè)定，隻需要5分鍾左右。由於(yú)染料與蛋白質結合的過程，大約隻要2分鍾即可完成，其顔色可以在1小時内保持穩定 ，且在5分鍾至20分鍾之間，顔色的穩定性 。因而*不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
（3）幹擾物質少 。如幹擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖(chōng)液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇 、EDTA等均不幹擾此測(cè)定法 。
此法的缺點是：
（1）由於(yú)各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 ，因此Bradford法用於(yú)不同蛋白質測(cè)定時有較大的偏差 ，在制作 标準曲線時通常選用 g―球蛋白爲标準蛋白質 ，以減少這方面的偏差。
（2）仍有一些物質幹(gàn)擾此法的測(cè)定，主要的幹(gàn)擾物質有 ：去污劑、 Triton X-100、十二烷基*（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸幹(gàn)擾Lowary法一樣）。
（3）标準曲線也有輕微的非線性 ，因而不能用Beer定律進行計(jì)算，而隻能用标準曲線來測(cè)定未知蛋白質的濃度。
（二）考馬斯亮蘭法試劑與器材
1. 試劑：
（1）标準蛋白質溶液 ，用 g―球蛋白或牛血清清蛋白（BSA），配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标準蛋白質溶液 。
（2）考馬斯亮蘭G―250染料試劑：稱(chēng)100mg考馬斯亮蘭G―250，溶於(yú)50ml 95%的乙醇後，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。
2. 器材：
（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì) （2）旋渦混合器 （3）試管16支
（三）考馬斯亮蘭法操作方法
1.
标準方法
（1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其餘試管分爲兩組按表中順序，分别加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的标準蛋白質溶液給各試管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然後用無離子水補(bǔ)充到0.1ml。zui後各試管中分别加入5.0ml考馬斯亮蘭G―250試劑 ，每加完一管 ，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免産生大量氣泡而難於(yú)消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管 。
（2）加完試劑2~5分鍾後，即可開始用比色皿，在分光光度計上測(cè)定各樣品在595nm處(chù)的光吸收值A595，空白對照爲第1号試管，即0.1mlH2O加5.0mlG―250試劑。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用後立即用少量95%的乙醇蕩(dàng)洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時間浸泡。
（3）用标準蛋白質量（mg）爲橫(héng)座标，用吸光度值A595爲縱座标，作圖，即得到一條标準曲線。由此标準曲線，根據測(cè)出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約(yuē)爲(wèi)0.50。
2. 微量法
當樣品中蛋白質濃度較稀時（10－100mg/ml）,可将取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對照則分别爲0.5ml或1.0ml H2O, 考馬斯亮藍G－250試劑仍加5.0ml, 同時作相應的标準曲線，測(cè)定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約爲0.29。
點擊交流