ELISA比色和顯色的方法

ELISA比色和顯色的方法

（1） 比色

比色前應先用潔淨的吸水紙拭幹闆底附著的液體，然後将闆正確放入酶标比色儀的比色架中。以軟闆爲載體的試驗，需先将闆置於标準96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色前，先将軟闆邊緣剪淨，這樣，此闆就可*平妥坐入座架中。
比色時應先以蒸餾水校零點
，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替标本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其後可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然後進行計算。
比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，将吸收波長寫於A字母的右下角，如OPD的吸收波長爲492nm，表示方法爲"A492nm"或"OD492nm"。


（2） 顯色

顯色是ELISA中的zui後一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的産物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間内，陰性孔可保持無色，而陽性孔則随時間的延長而呈色加強。适當提高溫度有助於加速顯色進行。在定量測定中，加入底物後的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況适當縮短或延長反應時間，及時判斷。

OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鍾後即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD産物用硫酸終止後
，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

TMB受光照的影響不大，可在室溫中置於操作台上，邊反應觀察結果
。但爲保證實驗結果的穩定性，宜在規定的适當時間閱讀結果。TMB經HRP作用後，約40分鍾顯色達，随即逐漸減弱，至2小時後即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基*（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪

，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。


（3） 酶标比色儀

酶标比色儀簡稱酶标儀，通常指於測讀ELISA結果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的适用於闆、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶标儀。酶标儀的主要性能指标有：測讀速度、讀數的準確性、重複性、度和可測範圍、線性等等。優良的酶标儀的讀數一般可到0.001，準確性爲±1%，重複性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值爲1.083，則該孔相對於空氣的真實A值應爲1.083±0.01（1.073~1.093），重複測定數次，其A值均應1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶标儀的可測範圍視各酶标儀的性能而不同。普通的酶标儀在0.000~2.000，新型号的酶标儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。應注意可測範圍與線性範圍的不同，線性範圍常小於可測範圍，比如某一酶标儀的可測範圍爲0.000~2.900，而其線性範圍僅0.000~2.000，這在定量ELISA中制作标準曲線時應予注意。

酶标儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30分鍾，測讀結果更穩定。 

       上海恒遠生物科技有限公司專業代理美國R&D、Amresco、Sigma、Pharmacia、Abcam等各*高質量試劑盒和生物科研試劑，産品涵蓋ELISA試劑盒、生物試劑、抗體、對照品、血清、細胞、培養基
、實驗耗材等，公司産品幾乎涉及所有領域，代表瞭zui高品質。

       上海恒遠生物科技有限公司是一家生物技術企業，主要從事免疫學、分子生物學和常規生化試劑的研發
、銷售。公司專業代理美國R&D、Amresco、Sigma、Pharmacia、Abcam等各*高質量試劑盒和生物科研試劑，産品涵蓋ELISA試劑盒、生物試劑、抗體、對照品、血清、細胞、培養基、實驗耗材等，公司産品幾乎涉及所有領域，代表瞭zui高品質。
    上海恒遠生物先後與河南中醫學院、複旦大學、同濟大學、上海交通大學、華東師範大學、第二軍醫大學、仁濟醫院、曙光醫院、華山醫院、瑞金醫院、上海有機研究所、中科院上海分院等多家單位建立瞭良好的合作關系。公司緻力於爲廣大高校、科研院所和企事業單位提供*的科研試劑和完善的技術服務，滿足生物化學、分子生物學 、細胞生物學、免疫學等生物科技實驗需求。
主要代理産品
：
試劑盒：ELISA試劑盒、檢測試劑盒、免疫組化試劑盒、分子生物學試劑盒、金标檢測試劑盒、細胞凋亡試劑盒、生化試劑盒等。
生物試劑：生化試劑、科研試劑、化工原料、化學試劑。
血清：内皮細胞血清、進口血清、GIBCO胎牛血清等。
抗體
：進口原裝抗體
、進口分裝抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、單标抗體、雙标抗體、多标抗體、一抗、二抗；免疫組化抗體、免疫熒光抗體、流式細胞抗體、免疫細胞化學抗體等。
細胞：*細胞、腫瘤細胞、正常細胞、腫瘤耐藥細胞等。
标準品：進口标準品、中檢所标準品。
培養基：顯色培養基、大腸杆菌培養基、幹燥培養基、其它菌檢測培養基等等。

：